手术后出现的认知能力变化统称为术后认知功能障碍，其最典型的表现为记忆力减退和学习能力下降，持续数月甚至数年。吸入麻醉剂如七氟醚、异氟醚、氧化亚氮(N2O)等诱导的神经毒性可能是发生术后认知功能障碍的原因之一[1]。由于大脑体积、神经递质种类、代谢功能等方面的原因，老年患者对麻醉药物引起的改变较年轻人更为敏感。

文献[2]报道，高达10%的老年患者在术后3个月内出现持续性的认知功能障碍；当该症状持续超过6个月时，可视为并发长期认知功能障碍。首个国际多中心临床研究(ISPOCD)[3]显示，与非手术麻醉组相比较，手术麻醉组患者在术后1周、3个月及1～2年认知障碍的发生率分别为10.4%、10.2%和0.9%。该研究表明，术后认知功能障碍在很大程度上表现为可逆性，较少发展为持续性。

麻醉药物对认知功能的影响取决于药物的药代动力学及药效学。麻醉药物作用时间越短，术后认知功能障碍持续时间也越短[4]。本课题组既往研究[5-6]已证实，七氟醚联合N2O吸入麻醉可致老年大鼠短期学习与记忆功能障碍，且海马区神经元细胞凋亡增加是其可能的机制之一。本课题采用1.3%七氟醚联合50%N2O作为吸入麻醉药(以50%O2为气体载体)，吸入麻醉4 h，进一步探讨七氟醚联合N2O吸入麻醉对老年大鼠短期及长期认知功能的影响，并探讨其海马区神经毒性。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立及分组 选择18月龄SD老年大鼠40只，质量250～300 g，随机分为麻醉组(22只)和对照组(18只)。麻醉组给予1.3%七氟醚+50% N2O 吸入4 h，对照组给予 50%O2吸入4 h，流量均为3 L/min。用电热毯维持大鼠直肠体温在(37.)℃。参考Culley等[7]的研究模型，使用多功能监护仪持续监测呼气末CO2(ETCO2)和吸入麻醉深度(MAC值)。麻醉组予以氧饱和度仪监测氧饱和度(SpO2), 为避免应激，对照组不监测SpO2。麻醉过程中保留自主呼吸，持续观察大鼠的呼吸频率、肢端颜色和口唇颜色。所有大鼠均饲养于复旦大学附属中山医院动物实验中心，自由饮水、摄食。饲养环境：12 h昼夜交替，室温22 ℃，湿度60%。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准。

1.2 检测方法 所有实验大鼠建模48 h后进行连续6 d定航训练，水迷宫实验第7天进行第1次空间探索实验，实验结束后随机抽取麻醉组6只及对照组6只大鼠用于免疫荧光检测。其余大鼠在水迷宫实验第14天行第2次空间探索实验，结束后断头取脑用于分子生物学分析。

1.2.1 Morris水迷宫实验 该实验包括定位航行和空间探索实验两部分。定航训练历时6 d，每天将大鼠面向池壁，分别随机从4个象限放入水中，共4次，通过摄像系统记录并分析大鼠游泳轨迹，大鼠寻找平台的最大时限设定为60 s，登台5 s视为成功，摄像系统停止记录。使大鼠在平台停留15 s，以提供时间让大鼠观察周围提示物，然后开始下一次训练。若大鼠在60 s内未找到隐蔽平台，摄像系统停止记录，人为引导大鼠寻找到平台并让其在平台上停留15 s。空间探索实验分别在第7天和第14天进行。去掉隐藏平台，任选除平台象限外的两个入水点将大鼠放入水池中，记录其在60 s内的游泳轨迹。

1.2.2 TUNEL/NeuN免疫荧光双标检测凋亡情况 对取材的大鼠腹腔注射600 mg/kg水合氯醛，迅速切皮，进胸，暴露心脏，灌注0.9%氯化钠液200 mL，先快后慢灌注4% 多聚甲醛 (PFA) 约300 mL，至大鼠四肢、尾巴僵硬，取出海马组织。将脑组织置于4% PFA，4℃过夜。10%、20%、30%蔗糖梯度脱水，OCT包埋剂包埋，以20 μm连续冰冻切片，每隔100 μm取1片冰冻切片进行室温干燥，用含0.5% Triton X-100和10%驴血清的0.01 mmol/L磷酸盐缓冲剂(PBS)室温封闭1 h。吸弃封闭液，加入一抗(NeuN，1∶500)，4℃冰箱孵育过夜；用含有5%血清的0.01 mmol/L PBS按1∶1 000稀释二抗，37℃孵育2 h。按照TUNEL染色试剂盒说明进行TUNEL染色，用含5%血清的0.01 mmol/L PBS溶液稀释的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1∶1 000)室温避光孵育30 min，荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照记录。

1.2.3 Western印记法检测凋亡蛋白 取固体脑组织加入预冷的含PMSF的细胞蛋白裂解液，超声震荡后离心吸取上清。采用BCA法测定所提蛋白的浓度。取30 μg蛋白样本于沸水中煮5 min，使蛋白变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳，在300～350 mA恒流条件下转入PVDF膜。随后用含5%脱脂奶粉的封闭液在室温条件下用摇床震荡2 h。用特异兔抗鼠分裂caspase-3抗体(cleaved-caspase-3， 1∶1 000，Epitomics)、兔抗鼠Bax抗体(1∶500，Santa Cruz)、兔抗鼠cleaved PARP抗体(1∶500，Santa Cruz)在4℃条件下孵育过夜，以β-actin作为内参(1∶1 000，Santa Cruz)。洗膜后与二抗(HRP标记山羊抗兔IgG，Santa Cruz)在室温孵育1 h，使用ECL高灵敏化学发光试剂盒进行显影。对胶片进行曝光，并进行灰度值分析。

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