血管性痴呆(Vascular Dementia,VD)是指由各种脑血管因素引起的脑组织损害，并伴有严重认知功能障碍的综合征，是一种慢性的进行性疾病，属于中医学“痴呆”范畴，其发病机制较为复杂，目前尚无有效的治疗手段[1-2]。近年来，中药在VD治疗中的作用逐渐引起关注。养血清脑颗粒是在中医名方“四物汤”的基础上改良而成的中药复方制剂，具有滋阴养血、活血通络、平肝潜阳等功效，临床上常用于治疗脑血管疾病[3]。文献[4]报道，养血清脑颗粒对慢性脑供血不足患者认知功能障碍及脑血流均有改善，且安全有效，但具体的作用机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨养血清脑颗粒对大鼠双侧颈动脉结扎所致认知功能障碍的改善作用及其作用机制，以期为其临床推广应用提供更多的实验依据。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级，雄性SD大鼠，6～7周龄，体质量220～250 g，购于赛业模式生物研究中心(太仓)有限公司，动物生产合格证号：SCXK(苏)2018-0003。饲养环境：饲养于屏障环境动物实验室，每5只1笼，温度(25±2)℃，湿度(55±2)%，光照明暗时间比为12 h/12 h，自由获取食物和水。

1.1.2 药物 养血清脑颗粒(天士力医药集团股份有限公司，国药准字Z)。

1.1.3 试剂与仪器 苏木精-伊红(HE)染色液(北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0061R)；TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)凋亡试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：T2190)；兔抗鼠生长相关蛋白-43(GAP-43)抗体(英国Abcam公司，批号：ab)；兔抗鼠突触后致密物质-95(PSD-95)抗体(美国Santa Cruz公司，批号：)等。切片机(上海亿欣生物科技有限公司，KD-2800型)；台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司，5417R型)；倒置荧光显微镜(德国Leica公司，DMI30B1型)；多功能酶标仪(瑞士TECAN公司，M200 PRO型)；QuantityOne 1-D分析软件(美国Bio-Rad公司)等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 采用双侧颈动脉永久性结扎的方法构建认知功能障碍大鼠模型：10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，颈前部备皮。颈正中线左侧旁开0.5 cm处行长约1 cm切口，钝性分离颈总动脉，4号丝线双重结扎；7 d后于颈正中线右侧旁开0.5 cm处行同样切口，并进行相同手术操作。另选择15只大鼠作为假手术组，仅做颈前切口，将双侧颈动脉分离、暴露，但不结扎。采用Morris水迷宫实验判断认知功能障碍大鼠模型是否构建成功，连续5 d，计算模型鼠逃避潜伏期均值与参考值(假手术组大鼠逃避潜伏期5 d的均值)之差以及差值与该均值的比值，若比值>20%，即表示造模成功。将成功建立的36只认知功能障碍大鼠随机分为模型组及实验组，每组18只[5]。

1.2.2 给药方法 实验组大鼠给予养血清脑颗粒[10 mL/(kg·d)，浓度为0.32 g/mL]灌胃，假手术组与模型组等量生理盐水灌胃，3组均连续干预4周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 Morris水迷宫实验[6]与Y型迷宫实验[7]测定大鼠的学习记忆能力 1)末次干预后进行Morris水迷宫实验：a.定位航行试验：将大鼠依次从4个象限放入水中，记录120 s内寻找平台的时间(逃避潜伏期)；若大鼠在120 s内未找到平台，逃避潜伏期记为120 s。实验历时5 d，取平均值。b.空间搜索试验：撤除平台，计算大鼠120 s内跨越原平台的次数及游泳的轨迹。2)Y型迷宫实验：a.学习能力测试：大鼠放入Y型迷宫适应5 min后施加电刺激(电压60 V，延时5 s)。大鼠受到电击后一次性逃往安全区判为正确反应，并让其在安全区停留30 s。当大鼠连续10次训练中有9次正确反应，则表示学习合格。记录大鼠达到9/10标准前所需的训练次数，以表征其学习成绩。b.记忆能力测试：训练结束后24 h，按上述方法训练大鼠10次，记录正确反应次数作为记忆成绩，以评价记忆能力的高低。

1.2.3.2 HE染色[8]观察大鼠海马组织病理学变化 各组大鼠学习记忆能力测定后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，分离、采集海马组织，4%多聚甲醛固定，常规制作石蜡切片，进行HE染色，光学显微镜下观察海马组织病理学特点。

1.2.3.3 TUNEL法[9]检测大鼠海马神经元凋亡情况 取石蜡切片，按照TUNEL凋亡试剂盒说明书进行操作。细胞核染为绿色为阳性细胞，即凋亡细胞，于倒置荧光显微镜下观察并计数阳性细胞数，计算细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.3.4 蛋白免疫印迹(Wb)法[10]检测大鼠海马组织GAP-43、PSD-95蛋白的表达水平 取-80 ℃保存的海马组织，加入裂解液在冰浴环境中匀浆，4 ℃条件下，12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法检测蛋白浓度。取待测蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后封闭，加入一抗GAP-43、PSD-95，4 ℃孵育过夜，加入二抗。采用QuantityOne 1-D图像处理分析软件分析各条带的灰度值，以目的条带灰度值/β-actin条带灰度值确定目的蛋白相对含量。

文章来源：《财会学习》 网址: http://www.chxxzz.cn/qikandaodu/2021/0303/681.html